在自然界中糖類物質(zhì)無處不在，幾乎參與了多細(xì)胞生物的全部生命過程。但是由于糖類化合物結(jié)構(gòu)固有的復(fù)雜性，想要獲得結(jié)構(gòu)明確均一的聚糖類化合物，合成難度大，往往需要具有高度專業(yè)技能的人員通過手工合成來完成，耗時(shí)費(fèi)力，這嚴(yán)重制約著糖科學(xué)的發(fā)展；而對(duì)于分子尺寸更大、結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的多糖類化合物的合成，更是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的工作。聚糖的高效獲取問題已成為制約糖科學(xué)發(fā)展的重要瓶頸。

糖 | Pixabay

多肽和DNA合成儀的研制成功，帶來了多肽/蛋白質(zhì)和寡核苷酸/核酸獲取途徑的革命，極大地推動(dòng)了相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。糖科學(xué)家也希望聚糖的合成能夠像多肽和寡核苷酸那樣在自動(dòng)合成儀上實(shí)現(xiàn)。近些年來，雖然聚糖固相自動(dòng)合成和酶法自動(dòng)合成取得了一定的進(jìn)展，但聚糖固相自動(dòng)合成往往需要過量的糖模塊和試劑，通常是通過單糖逐個(gè)累加的方式使糖鏈延伸（加法式合成），造成效率低下，而且合成規(guī)模較小、無法直接監(jiān)測(cè)反應(yīng)。酶法自動(dòng)合成雖然能夠獲得一些天然的生物活性寡糖，但酶的來源有限、底物適應(yīng)范圍窄，無法滿足各種類型的寡糖合成需要；而且酶法往往需要核苷活化的糖，價(jià)格比較昂貴；其糖鏈的延伸也是通過單糖逐個(gè)累加的方式而實(shí)現(xiàn)（即加法式合成）。因此，糖自動(dòng)合成技術(shù)的發(fā)展還處于初級(jí)階段。

(資料圖)

論文截圖

他們基于“預(yù)活化”一釜多組分寡糖合成原理，自主研發(fā)了全球首臺(tái)新型雙模式液相糖自動(dòng)合成儀，并利用該合成儀自動(dòng)合成了各種具有重要生物活性的復(fù)雜寡糖和多糖；發(fā)展了“自動(dòng)乘法合成”策略，將合成的多糖尺寸提高到驚人的1080-mer，從而將聚糖合成水平提升到了一個(gè)新的高度，遠(yuǎn)超核酸（到200-mer）和蛋白質(zhì)（到472-mer）的合成水平。

葉新山團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于新的糖化學(xué)合成的方法和策略的發(fā)展。2004年，他與黃雪飛教授首次明確提出“糖基供體預(yù)活化”的新概念，提出了糖基化反應(yīng)的一種新方式，在此基礎(chǔ)上發(fā)展了基于“糖基供體預(yù)活化”的一釜寡糖合成新策略（Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, 5221）。該策略的優(yōu)點(diǎn)是只使用帶有常見保護(hù)基的糖模塊，不需要對(duì)反應(yīng)中間產(chǎn)物進(jìn)行分離，省去了中間體分離純化的步驟，從而使合成效率提高。目前該策略已經(jīng)被應(yīng)用于各種復(fù)雜聚糖的合成，特別是該團(tuán)隊(duì)在2017年運(yùn)用這個(gè)策略首次合成了均一結(jié)構(gòu)的由92個(gè)單糖單元所組成的阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan），開創(chuàng)了多糖合成領(lǐng)域的先河（Nat. Commun., 2017, 8, 14851）。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)展了光介導(dǎo)的“預(yù)活化”一釜糖基化反應(yīng)，展示了其綠色、高效和可控性強(qiáng)的特點(diǎn)（Org. Chem. Front., 2016, 3, 737）?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，該團(tuán)隊(duì)著手進(jìn)行糖合成儀的研制工作。

圖1 液相糖合成儀

合成儀的研制包括硬件和軟件兩個(gè)方面。

硬件主要包括三部分：自動(dòng)合成系統(tǒng)（包含自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)和合成輔助系統(tǒng)），在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)和可編程邏輯控制系統(tǒng)。他們首先設(shè)計(jì)研發(fā)了新型可溫控反應(yīng)器，既能夠滿足光驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)，也能滿足普通的各種反應(yīng)類型，適用溫度范圍在-80 ℃-100 ℃之間；緊接著設(shè)計(jì)研發(fā)密閉、雙重控制的準(zhǔn)確自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)在惰性氣體保護(hù)下，密閉且無交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，配合相應(yīng)的控制方案可適用于各種自動(dòng)化合成；隨后設(shè)計(jì)研發(fā)接近實(shí)時(shí)的在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，可以滿足連續(xù)多次無交叉自動(dòng)取樣、進(jìn)樣、分析、對(duì)比判斷，充分利用液相色譜的分析能力滿足自動(dòng)合成的直接監(jiān)測(cè)需要；最后通過可編程邏輯控制系統(tǒng)耦合自動(dòng)合成系統(tǒng)和在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，成功設(shè)計(jì)了新型雙模式液相糖自動(dòng)合成儀的整機(jī)框架，實(shí)現(xiàn)了第一代原型機(jī)的順利組裝（圖1）。

軟件方面，可編程邏輯控制系統(tǒng)受上位機(jī)控制，基于Labview語言程序設(shè)計(jì)研發(fā)了實(shí)用的特色上位機(jī)軟件控制系統(tǒng)（Ye Glycosoft），完成對(duì)合成儀的整機(jī)控制和調(diào)試，實(shí)現(xiàn)了合成儀的穩(wěn)定運(yùn)行。

在合成儀原型機(jī)成功研發(fā)的基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)首先用一個(gè)四糖的合成來驗(yàn)證儀器的可靠性，分別通過普通活化模式和光介導(dǎo)活化模式對(duì)四糖進(jìn)行自動(dòng)化合成，驗(yàn)證了合成儀的可行性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證糖合成儀的功能，該團(tuán)隊(duì)利用所研制的合成儀，進(jìn)行了如下三個(gè)方面的工作：

圖2 普通活化模式下生物活性寡糖的自動(dòng)合成

1. 用合成儀合成了一個(gè)含有多種重要生物活性寡糖的化合物庫。

他們首先在普通活化模式下（一般以Ph2SO/Tf2O或者p-TolSCl/AgOTf作為活化體系），通過一釜五組分反應(yīng)（1*5 = 5）完成了兩種β-1,6連接的葡聚五糖的自動(dòng)化合成；隨后在此基礎(chǔ)上通過一釜三組分反應(yīng)（5*3 = 15）完成了β-1,6連接的葡聚十五糖的自動(dòng)化合成。

此外，通過一釜五組分反應(yīng)（1*5 = 5）完成了甘露五糖的自動(dòng)合成；通過一釜四組分（1*4 = 4）和一釜五組分反應(yīng)（1*5 = 5）分別完成了β-1,4-連接的殼聚四糖和殼聚五糖的自動(dòng)合成；通過[1+2+1+2]策略一釜自動(dòng)合成了結(jié)構(gòu)復(fù)雜、具有重要活性的腫瘤相關(guān)糖抗原Globo H；含有高碳糖唾液酸的腫瘤相關(guān)糖抗原Fucosyl GM1 (Fuc-GM1)和cis-糖苷鍵的A血型糖抗原也都被成功構(gòu)建（圖2）。

接下來，在光介導(dǎo)模式下，以Umemoto試劑作為光活化劑，作為N-聚糖和多種腫瘤相關(guān)糖抗原核心骨架的polyLacNAc八糖通過四組分反應(yīng)(2*4 = 8)被成功構(gòu)建；緊接著作者通過一釜三組分策略完成了以LNT（Lacto-N-tetraose）和LNnT（Lacto-N-neotetraose）為核心結(jié)構(gòu)的七種重要生物活性抗原（H型抗原、B/O血型抗原和LewisX、LewisY抗原）的自動(dòng)化合成（圖3），這些抗原是人乳寡糖和鞘糖脂的重要組成部分。

圖3 光介導(dǎo)活化模式下生物活性寡糖的自動(dòng)合成

2. 以克級(jí)規(guī)模高效自動(dòng)制備保護(hù)的磺達(dá)肝葵鈉五糖。

磺達(dá)肝葵鈉是首個(gè)也是目前唯一一個(gè)人工合成的已上市肝素類寡糖抗凝藥物，于2002年上市。雖然目前已有化學(xué)合成和化學(xué)酶法合成的報(bào)道，然而超過50步、總收率低于0.1%的化學(xué)合成使其成為最貴的肝素類藥物，限制了其應(yīng)用。該團(tuán)隊(duì)以p-TolSCl/AgOTf作為活化體系，通過[1+2+2]策略高收率地自動(dòng)合成了保護(hù)的磺達(dá)肝葵鈉五糖（圖4）。這是磺達(dá)肝葵鈉五糖的首次自動(dòng)化制備，其合成規(guī)模易于放大的特點(diǎn)對(duì)于磺達(dá)肝葵鈉制備工藝的改進(jìn)具有重要意義。

圖4 克級(jí)規(guī)模自動(dòng)制備保護(hù)的磺達(dá)肝葵鈉五糖

3. 多組分自動(dòng)乘法合成阿拉伯聚糖。

在前面工作基礎(chǔ)上，作者開始研究一釜更多組分?jǐn)?shù)的自動(dòng)合成和大分子尺寸多糖的自動(dòng)組裝。他們選擇了植物和致病菌細(xì)胞壁都普遍存在的阿拉伯聚糖作為合成目標(biāo)。以p-TolSCl/AgOTf作為活化體系，能夠以一釜十組分反應(yīng)（1*10 = 10）實(shí)現(xiàn)阿拉伯十糖的自動(dòng)化合成，分離收率為47%（平均每步92%），完成了手工合成難以完成的工作。

在高收率克級(jí)規(guī)模自動(dòng)制備阿拉伯六糖的基礎(chǔ)上，作者繼續(xù)通過自動(dòng)乘法合成策略來制備大分子尺寸的阿拉伯聚糖。反應(yīng)過程包括重復(fù)的兩次操作：（1）自動(dòng)一釜多組分反應(yīng)獲得供體中間體；（2）脫除供體中間體上的臨時(shí)保護(hù)基得到受體中間體。從單糖模塊出發(fā)，自動(dòng)一釜六組分反應(yīng)得到六糖供體（1*6 = 6），脫除六糖供體上的臨時(shí)保護(hù)基（TBS）得到六糖受體；自動(dòng)一釜五組分反應(yīng)得到三十糖供體（1*6*5 = 30），脫除三十糖供體的臨時(shí)保護(hù)基得到三十糖受體；自動(dòng)一釜四組分反應(yīng)得到一百二十糖供體（1*6*5*4 = 120），脫除一百二十糖供體的臨時(shí)保護(hù)基得到一百二十糖受體；自動(dòng)一釜三組分反應(yīng)得到三百六十糖供體（1*6*5*4*3 = 360），脫除三百六十糖供體的臨時(shí)保護(hù)基得到一個(gè)三百六十糖受體；自動(dòng)一釜三組分反應(yīng)[360+360+360]，得到驚人的1080糖（分子量達(dá)到352,700 Da）。該大分子尺寸的阿拉伯聚糖通過五步乘法擴(kuò)增獲得（1*6*5*4*3*3 = 1080），是目前人工合成的最大、最長(zhǎng)的均一結(jié)構(gòu)的多糖分子。最后，作者通過優(yōu)化條件，將保護(hù)的1080糖進(jìn)行保護(hù)基脫除（1個(gè)TBS、1080個(gè)Bz和1080個(gè)Bn，共2161個(gè)保護(hù)基），得到完全脫保護(hù)的1080糖（分子量達(dá)到142,800 Da）（圖5）。

圖5 由單糖開始自動(dòng)乘法合成線性1080-mer阿拉伯聚糖

總結(jié)：該團(tuán)隊(duì)基于糖基供體“預(yù)活化”一釜寡糖合成和連續(xù)乘法合成原理，研制出一種新型雙模式的液相糖自動(dòng)合成儀，它克服了現(xiàn)有的通過單糖逐個(gè)累加方式延伸糖鏈方法的缺陷。

該合成儀的實(shí)用性從三個(gè)方面得到了驗(yàn)證：

在普通活化模式或者光介導(dǎo)活化模式下，成功合成了包括各種糖型和糖苷鍵、具有重要生物活性的寡糖化合物庫；

合成了保護(hù)的抗凝糖藥物磺達(dá)肝葵鈉五糖，可以實(shí)現(xiàn)克級(jí)規(guī)模的制備；

成功執(zhí)行了“一釜”十組分自動(dòng)偶聯(lián)反應(yīng)得到阿拉伯十糖；進(jìn)而利用自動(dòng)乘法合成策略，合成了結(jié)構(gòu)均一的阿拉伯聚糖（1080糖?。?/p>

這代表著人工合成均一結(jié)構(gòu)生物大分子復(fù)雜度的單體組成數(shù)目首次達(dá)到了四位數(shù)水平，在多糖合成領(lǐng)域具有重要的里程碑式意義。

該合成儀將為非專業(yè)人員提供一個(gè)組裝目標(biāo)聚糖的平臺(tái)，填補(bǔ)國內(nèi)外在液相糖合成儀研制方面的空白，將為糖科學(xué)及其在醫(yī)藥和材料領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的有效的工具。

供稿：科學(xué)網(wǎng)

研究團(tuán)隊(duì)

通訊作者葉新山：教授，北京大學(xué)藥學(xué)院

第一作者姚文龍：博士后，北京大學(xué)藥學(xué)院